考馬斯亮藍G-250法(Coomassie brilliant blueG-250)是一種利用蛋白質-染料結合的原理,定量測定微量蛋白質濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式,紅色和青色。該染料在游離狀態下為紅色,在酸性溶液中可與蛋白質的疏水區結合,顏色由紅色轉變成青色,其最大光吸收由 λ 465 nm變成 λ 595 nm。在一定蛋白質濃度范圍內(1-1000μg),蛋白質-染料復合物在 λ 595 nm下的吸光度與蛋白質含量成正比。蛋白質和染料結合是一個很快的過程,約2 min即可反應完全,呈現最大光吸收,并可穩定1 h,之后蛋白質-染料復合物發生聚合并沉淀出來。

1 試劑

10.05 mol/L 磷酸緩沖液(PBSpH 7.8

2100 μg/ml標準蛋白質溶液

3)考馬斯亮藍試劑

2 實驗方法

       2.1 標準曲線的繪制

        取6支試管,按下表加入各試劑,混合均勻后向各管中加入2.5 ml考馬斯亮藍試劑,搖勻并放置5 min左右,以0號試管為空白對照,在 λ 595 nm下測定吸光度。以蛋白質含量為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2.2 樣品前處理

稱取0.2 g樣品置于預冷的研缽中,分三次加入6 ml2 ml2 ml2 ml)預冷的磷酸緩沖液(pH 7.8),在冰浴上研磨成勻漿,轉入10 ml離心管中,低溫12000 r/min離心20min,上清夜即為蛋白粗提液。

2.3 測定方法

吸取0.5 ml蛋白粗提液(用蒸餾水適當稀釋后)放入試管中,加入2.5 ml考馬斯亮藍試劑,搖勻并放置2 min左右,以0號試管為空白對照,在 λ 595 nm下測定吸光度,通過標準曲線方程查得蛋白質含量。

2.4 計算公式


其中:

可溶性蛋白含量以每毫克每克鮮重表示(mg/g·FW);

C為查標準曲線值(μg);

Vt為提取液總體積(ml);

Vs為測定時提取液用量(稀釋前)(ml);

W為樣品鮮重(g)。