生物體內的短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFA)是大腸細菌代謝的主要終產物,主要由厭氧微生物發酵難消化的碳水化合物而產生。當前用于檢測糞便、血漿、血清、腦脊液、唾液、呼出氣、瘤胃液、腸內容物、糞便培養液等生物樣品中SCFA的方法較多,各有優劣。


生物樣品中SCFA的分析
1 樣品前處理方法
        生物樣品的前處理是體內藥物分析及內源性成分分析最為關鍵的一步。生物樣品中的SCFA極性大、揮發性強和水溶性大的獨特性質決定了其前處理方法與中鏈和長鏈脂肪酸有較大區別。目前已分析了SCFA的生物樣品主要有糞便、血清/血漿、呼出氣、唾液、瘤胃液、腸內容物等,這些樣品的前處理方法有如下幾種。
1.1 蒸餾法
        蒸餾法是指利用被測物質中各組分揮發性的不同來進行分離的方法,具有設備簡單、容易操作、成本低、提取率高等優點。 此法已用于分析糞便、血清/血漿樣品中的SCFA。然而采用蒸餾法處理糞便樣品時對樣品量需求較高;且對于血漿樣品會使其中的乙酰基熱解,從而增高乙酸值;此外,在強酸酸化過程中會造成蒸汽污染。因此,蒸餾法現已很少用于生物樣品SCFA的分析。
1.2 高速離心法
        高速離心法是指利用離心機在高速旋轉時產生的離心力使樣品達到分離目的的操作過程,屬于物理分離技術。此方法操作簡便、有助于縮短工作流程,并能降低樣品損耗。此法已用于分析糞便、血清/血漿樣品中的SCFA。但高速離心法需要使用高速離心機;分離糞水樣品時容易混有其他類型的有機酸。
1.3 超濾法
        超濾法是使用超濾膜對溶液中各種溶質分子進行選擇牲過濾的方法,溶液在一定壓力下或離心力作用下通過超濾膜時,溶劑和小分子通過,而大分子或固體顆粒受阻保留。超濾膜的分子截留量通常1~1000KD之間,選用不同分子截留量的超濾膜,可以將相對分子質量在幾百到幾十萬道爾頓之間的物質進行分離。這是近年來發展起來的新方法,具有操作簡便、實驗條件溫和、分離速度快、回收率高等優點。此法已用于分析糞便、血清/血漿樣品中的SCFA。采用超濾膜處理樣品時,有一部分有機酸會吸附在濾膜上,造成定量不準確,且含量低的樣品不易被檢測出;此外,超濾膜通常為一次性用品,實驗成本較高。
1.4 去蛋白
        含有蛋白質的體液在測定時會產生泡沫、渾濁或沉淀而干擾測定,另外,用RP-HPLC法進行分析時,體液中的蛋白質(以及脂類、鹽類和其他內源性雜質)會沉結在色譜柱上,大大縮短色譜柱的壽命。因此,生物樣品分析時去蛋白是必要的。常用的去蛋白方法有加酸沉淀法、加有機溶劑沉淀法、鹽析法、等電點沉淀法等。常用的酸沉淀劑有高氯酸、三氯乙酸和磺基水楊酸等,其中高氯酸去蛋白較完全,但降低了檢測樣品的pH而造成儀器損傷。使用有機溶劑去蛋白則可以較好的從變性蛋白上萃取出分析物,并且可以克服酸沉淀法的缺點,常用的有機溶劑沉淀劑有甲醇、乙腈、異丙醇等,它們沉淀蛋白的能力大小一般為:乙腈>丙酮>乙醇>甲醇。
1.5 萃取法

        萃取法包括液-液萃取(Liquid-liquid extraction, LLE)、液-固萃取法(Liquid-solidextraction, LSP)、固相微萃取 (Solid phase microextraction, SPME)、液相微萃取(Liquidphase microextraction, LPME)和液膜分離(Liquid membrane permeation, LMP)。萃取法適用于大多數生物樣品的前處理,他們的優缺點及適用的生物樣品如下。 

        LLE

提取操作簡單、 成本低、不需要特殊的實驗設備
難以實現自動化,回收率低
糞便、血清 /血漿
        LSP
凈化效果好、回收率高、重現性 好、所需溶劑量小、對成分選擇性高
載面積小,流量低;易堵塞;易產生縫隙而降低提取效率
糞便、血清 /血漿
        SPME
所需溶劑量小; 設備簡單,易與 GC,GC/MS聯用,且有著良好的靈敏度;所需樣品量少,為 1~10mL
萃取頭比較昂貴,易碎,壽命較短;新萃取頭老化所用涂層可能有污染物
糞便、血清 /血漿
        LPME
克服了固相微萃取可能存在的交叉污染問題,
萃取回收率易受多種因素影響
血漿、尿液、 唾液
        LMP
萃取與反萃取同時進行、萃取劑用量少和溶劑流 失量少
萃取回收率易受多種因素影響
血清/血漿
1.6 衍生化
        衍生化是利用化學反應將待分析化合物轉化成為一些化學結構類似的其他物質。其作用主要是把難于分析的物質 轉化為易于分析的化學結構相似的物質,更方便的應用于分離和檢測。一般化學衍生化的目的主要有:提高樣品檢測的靈敏度;改善樣品混合物的分離度;適合于進一步做結構鑒定,如質譜、紅外或核磁共振等。 在利用GC分析SCFA時,由于羧基的極性大,在GC柱中容易產生吸附從而使結果的重現性差,這種情況在低濃度 (<1mmol/L)會時常發生,因此SCFA常需要先衍生化處理才能進入GC柱。SCFA衍生化還可以降低某些揮發性酸的蒸發損失。用苯甲酰基甲基溴酯化SCFA,可以減少SCFA的損失, 增加衍生化效率。SCFA常被衍生成位芐基酯或五氟芐基酯。 在利用HPLC或CE分析SCFA時,由于脂肪酸分子結構中缺乏具有紫外吸收和熒光的基團,常對脂肪酸進行衍生化后用紫外或熒光檢測器檢測。紫外衍生試劑往往含有芐基、對硝基芐基、對-甲硫代芐基、苯甲酰甲基、對-溴苯甲酰甲基等基團。常用的熒光衍生試劑一般有香豆素類、重氮甲烷類、喹啉類、苯并酰肼類以及磺酸酯類化合物。
2 SCFA的檢測方法
2.1 GC法
        由于SCFA極易揮發,因此GC在SCFA分析中使用最為廣泛。在GC分析中,程序升溫、分流比、色譜柱類型、載氣和檢測器等條件都是決定測定結果準確度和可靠性的重要因素,因此建立分析方法時,均需對這些分析條件進行系統優化。 氫火焰離子化檢測器(FID)是測定SCFA最常用的檢測器之一,它的靈敏度較高。但生物樣品中的SCFA含量一般較低,因此用FID不易實現SCFA準確定量,且重現性低,尤其在甲酸的檢測中不常用FID。由于GC與MS聯用具有更高的靈敏度及選擇性,且集定性、定量分析于一體,因此MS已成為當前分析生物樣品中SCFA的最有效檢測器。
2.2 HPLC法
        HPLC法在定性、定量測定SCFA的分析過程中條件溫和,準確度好,且可選用的檢測器多。目前主要是將SCFA進行柱前或柱后衍生化后,采用反相色譜柱或離子交換色譜柱分離,再采用紫外或熒光檢測器檢測。由于采用此法分析SCFA需要進行衍生化處理(操作繁瑣、需優化衍生化條 件等)或需采用離子色譜(采用離子交換柱分離,分析成本高、普及率低;或在流動相中添加離子對試劑,操作繁瑣、 減少儀器或色譜柱使用壽命),因此限制了其在SCFA分析中的應用。